# 橡胶草重测序与天然橡胶含量分析方案

## 数据基础与本轮实施

现有129份重测序材料来自一个F1家系，包括2个亲本和127个子代。论文S7给出每材料天然橡胶含量（%）；正文描述为三次测定平均值，原始重复测定未公开。128份材料的S1总reads数与归档FASTQ的KMC日志精确唯一一致；本轮采用其中126个F1，排除两亲本和R09。材料配对依据保存到逐样本表，不把用户自行计算的VCF说成作者公开VCF。论文bin编码与原SNP的一致性尚未闭环，结果定位为本家系的探索性关联。

本轮按用户要求执行GLM和MLM，使用TK1151参考的现有PASS VCF。共享同一份基因型QC、PCA与亲缘矩阵；GLM加入PC1–PC3，MLM再加入基因组亲缘随机效应。分析双等位SNP，单基因型DP≥5、位点缺失≤10%、MAF≥0.05，样本缺失≤15%；剔除子代间GT剂量不变化的位点（包括全体固定杂合）；不对F1使用自然群体HWE筛选。阈值按实际有效检验数计算Bonferroni，另报告BH FDR。网站提供两模型切换、Manhattan/QQ图、真实关联记录、显著/非显著状态、过滤下载与方法/材料来源。QC后的样本数和位点数以实际产物为准，不预填结果。

## 建议的后续分析

| 优先级 | 分析 | 能回答的问题 | 具体输出与范围 |
|---|---|---|---|
| 1 | 两模型一致性与位点稳健性 | 哪些关联在GLM、MLM中方向与证据一致 | 两模型结果对照、效应/标准误、QQ与膨胀系数；显著位点按实际结果筛选，允许无显著结果 |
| 1 | 预先限定的敏感性与功效检查 | 关联是否依赖某一种协变量或GT筛选条件 | 固定主分析后，在预先规定的PC数量和测序深度条件下比较方向与证据；不选择最小P值作为最终模型。功效与重抽样方法需考虑本家系的亲缘依赖 |
| 1 | 已发表QTL重叠 | 新关联与已发表六个标记位置是否一致 | 同参考坐标核验后计算距离与重叠；论文标记区间不当作完整置信区间 |
| 1 | 候选区域LD与单倍型 | 相邻关联是否属于同一遗传区段，哪些等位组合与含量相关 | 对实际有证据的区域计算LD、分组表型和单倍型效应；展示每组真实n，控制多重比较，不预先扩大区间 |
| 1 | 变异功能注释与候选基因排序 | 关联变异影响哪些基因或调控区域 | 真实REF/ALT、编码/剪接/上下游注释、同源/结构域和天然橡胶合成通路证据；区分预测影响与实验证据 |
| 2 | 基因层面的公共表达/蛋白证据整合 | 候选基因是否在根、乳汁或相关处理中表达 | 按统一基因ID连接已有表达、蛋白、通路资源；不同材料的数据只作基因层支持，不冒充同样本联合分析 |
| 2 | 家系分离与基因型质量分析 | 哪些区域的分离或缺失模式异常 | 先核实亲本真实GT及杂合性，再按相应分离类型检验；不能统一假设全基因组1:2:1 |
| 2 | 加性/显性效应和多位点组合 | 已筛选位点能解释多少家系内差异 | 预先限定候选数量、加入显性项、交叉验证或bootstrap；避免用同一批数据选择位点后报告夸大的解释率 |
| 2 | SNP遗传率与家系内预测 | 当前基因型能解释和预测多少表型变化 | 估计方差组分并报告不确定性；单家系样本较少，不能把家系内交叉验证准确率当成跨品系育种效果 |
| 3 | 分子标记设计 | 能否把候选等位基因转成可测试标记 | 在实际持有材料中核验GT、目标参考和上下游序列，再设计KASP/InDel候选；需新增独立材料或实验验证 |

## 目前不具备直接开展条件的项目

多环境BLUP/BLUE与G×E需要环境和重复原始记录；当前只有最终平均含量。eQTL/sQTL需要同一批126份材料的表达/剪接矩阵，现有公共RNA数据不能代替。正式连锁QTL复算需要原始连锁输入、bin构建/相位规则或可靠重建流程。SV/CNV和泛基因组需要对应调用结果/组装证据，不能从现有SNP表直接宣称已有。广泛转移的预测或育种效果需要独立家系/群体验证。

建议实施顺序为：本轮GLM/MLM与科学验收 → 实际候选位点和已发表QTL对照 → 局部LD/单倍型与功能注释 → 基因层表达/蛋白/通路证据整合 → 优先候选标记与独立验证。没有显著关联时，先报告模型功效、数据质量与不确定性，不转而选择未经纠正的小P值作为结果。

## 本轮结果后的优先顺序

实际纳入126个F1、1,109,918个可变剂量SNP。Bonferroni阈值约4.505×10⁻⁸：GLM1个、MLM0个；FDR≤0.05分别为1和46个。最低P位点为Chr06:91,279,448（T>C），GLM P=4.488×10⁻⁸，MLM P=5.14704×10⁻⁸。该位点只是GLM边界显著，不能描述为两模型共同确认的QTL。

首先核查领先位点的真实携带组、GT质量与影响点，再做预先限定的PC/深度条件敏感性及局部LD。F1-78的源表型为15.1398238196888%，属于当前残差诊断的影响点候选；本轮保留原值和材料，不用删点获取显著结果。MLM拟合收敛但亲缘随机项接近零边界，应把该条件估计与性状遗传率区分开。

领先位点最近基因的原生ID为TkA06G368510（源库正式ID TkokChr06G003387），距已存储基因边界13,907 bp；位置关系和“未知功能”注释不足以证明其参与天然橡胶合成。原文已发表bin标记位置对照、局部LD/单倍型和多来源功能证据，应放在独立标记设计与实验前。